Pracovné činnosti

1. Zabezpečenie výberu pacientok, komunikácia s nimi (podľa požiadaviek etickej komisie), odber materiálu

Zodpovedné osoby: Doc. MUDr. Miroslav Korbeľ CSc, Doc. MUDr. Jozef Záhumenský, PhD.

Nábor pacientok (cca 200) prebieha počas pravidelných lekárskych prehliadok, pacientka je riadne informovaná o povahe a význame projektu ako aj o (ne)rizikách jej účasti na projekte. Etické aspekty boli evaluované lokálnou etickou komisiou. Pacientka má k dispozícii text „Informácia pre pacienta“ a „Informovaný súhlas pacienta“. Zároveň lekár vyplnení „Formulár s relevantnými informáciami o pacientovi“. Vzorky sa pripravújú z popôrodných placent zdravých žien a z placent žien s príznakmi preeklampsie (rôzne štádiá a komplikácie), po prirodzenom alebo umelom oplodnení. Vzorky sú transportované v príslušných roztokoch a následne poskytnuté na histologickú, imunolokalizačnú, genetickú a proteomickú analýzu. Anonymné údaje z „Formulára s relevantnými informáciami o pacientovi“ sú poskytnuté pre potreby vyhodnotenia, štatistického spracovania a interpretácie výsledkov analýz. Výsledkom je zber klinicky charakterizovaných vzoriek potrebných pre ďalšie pracovné balíky.

2. Histologická charakterizácia analyzovaných tkanív, imunolokalizácia syncytínu 1 vo vzorkách preeklamptických a fyziologicky normálnych

Zodpovedné osoby: Prof. MUDr. Ľudovít Danihel, CSc, MUDr. Katarína Letkovská, PhD.

Vzorky odobraté z tkaniva placenty fixujeme vo formalíne (v tom sú už transportované) a zalievame do parafínových bločkov. Z nich sú štandardným postupom vyhotovené preparáty farbené hematoxylínom a eozínom, ktoré hodnotíme pomocou svetelného mikroskopu. Selektované vzorky sú spracované metódou imunoflorescencie a expresiu syncytínu 1 hodnotíme pomocou fluorescenčného mikroskopu. Sledujeme prípadné rozdiely v expresii syncytínu 1 v placentárnom tkanive zdravých a preeklamptických pacientok.

3. Genomika a proteomika

Zodpovedné osoby: Doc. Ing. Helena Gbelcová, Ph.D, Mgr. Petra Priščáková, PhD.

Vzorky odobraté z tkaniva placenty prenášame v príslušnom tlmivom roztoku. Genetickú variabilitu regulačného regiónu ERVW-1 sledujeme metódou priameho sekvenovania. Expresiu divokého typu génu ERVW-1 a génu ERVW-1 s výskytom DNA variantu porovnáme metódami real-time PCR (detekcia množstva mRNA), a Western blot (stanovenie množstva proteínového produktu génu ERVW-1 - syncytínu-1). Tieto metódy používame na určenie vplyvu daného DNA variantu na zmeny v množstve syncytínu-1, ktorého abnormálne množstvá sú u žien s preeklampsiou opisované. Pri real-time PCR používame špecifické TaqMan próby. Pri western blot analýze používame protilátky voči obom podjednotkám syncytínu-1.

4. Štatistické spracovanie, vyhodnotenie, interpretácia a diseminácia výsledkov

Zodpovedné osoby: RNDr. Katarína Sušienková, PhD.

Na základe vybraných parametrov anamnézy žien zapojených do projektu ich triedime do kategórií, v rámci a medzi ktorými hľadáme adekvátne genetické markery. Získané výsledky vyhodnocujeme pomocou štatistických metód s cieľom potvrdiť diagnostickú významnosť identifikovaných DNA variantov a dopad na expresiu génu ERVW-1 ako aj na závažnosť priebehu ochorenia.

5. Databáza

Varianty


			VARIANT	rs112171707	rs150596337	-	rs555416193	rs149888808	-	rs1238265137	rs192755521	rs4727276	rs569899772	rs990071845	rs944910258	rs911934432	rs187902619	rs191798317	rs144621394
			LOKALIZÁCIA VZHĽADOM NA ERWV-1	c.-2378C>A	c.-2372G>A	c.-2349_-2350insA	c.-2084C>T	c.-2048G>A	c.-1973A>T	c.-1972G>T	c.-1514T>C	c.-1284G>C	c.-1068C>T	c.-667A>G	c.-664A>G	c.-644A>G	c.-631T>C	c.-628C>A	c.-519C>T
			GENOMICKÁ LOKALIZÁCIA	92479532	92479526	92479503 - 92479502	92479238	92479202	92479127	92479126	92478668	92478438	92478222	92477821	92477818	92477798	92477785	92477782	92477673
PORADOVÉ ČÍSLO	PE / FN	DIAGNÓZA	POČET MUTÁCIÍ
1	FN		1									homozyg.
2	FN	gestačná hypertenzia	1															heterozyg.
3	FN		0
4	HD	PE, HELLP	0
5	HD	PE	2									heterozyg.							heterozyg.
6	FN		2		heterozyg.													heterozyg.
7	FN		1									heterozyg.
8	FN		1						heterozyg.
9	FN		0
10	HD	PE	2		heteroyg.														heterozyg.
11	HD	PE, HELLP	1	homozyg.
12	FN		0
13	FN		0
14	HD	PE	0
15	FN		0
16	HD	gestačná hypertenzia	1									heterozyg.
17	FN		1	heterozyg.
18	FN		1		heterozyg.
19	FN		0
20	HD	PE	0
21	FN		2	heterozyg.								heterozyg.
22	HD	IUGR	1	heterozyg.
23	FN		2							heterozyg.		hetrozyg.
24	HD	PE neskorá	1				heterozyg.
25	FN		1									heterozyg.
26	FN		1	heterozyg.
27	FN		0
28	FN		1									homozyg.
29	FN		1		heterozyg.
30	FN		1								heterozyg.
31	HD	getačná hypertenzia	1									heterozyg.
32	FN		0
33	HD	PE neskorá	0
34	FN		0
35	FN		0
36	FN		0
37	FN		1									heterozyg.
38	HD	PE, HELLP	0
39	FN		0
40	FN		0
41	FN		0
42	HD		1									heterozyg.
43	HD		0
44	HD		0
45	HD		1	heterozyg.
46	HD		1									heterozyg.
47	HD		0
48	HD		2	heterozyg.			heterozyg.
49	HD		1									heterozyg.
50	HD		0
51	HD		0
52	HD		1									homozyg.
53	HD		2	heterozyg.							heterozyg.
54	HD		0
55	HD		0
56	HD		1			homozyg.
57	HD		0
58	HD		0
59	HD		1									heterozyg.
60	HD		1									heterozyg.
61	HD		1									heterozyg.
62	HD		1									heterozyg.
63	HD		0
64	HD		1									heterozyg.
65	HD		2		heterozyg.							heterozyg.
66	HD		1									heterozyg.
67	HD		1									heterozyg.
68	HD		1									heterozyg.
69	HD		1									homozyg.
70	HD		0
71	HD		2	heterozyg.								heterozyg.
72	HD		1	heterozyg.
73	HD		0
74	HD		1									heterozyg.
75	HD		0
76	HD		2		heterozyg.							heterozyg.
77	HD		2				heterozyg.					heterozyg.
78	HD		0
79	HD		2	heterozyg.								heterozyg.
80	HD		1		heterozyg.
81	HD		0
82	HD		0
83	HD		2	heterozyg.								heterozyg.
84	HD		0
85	HD		0
86	HD		1									heterozyg.
87	HD		1									heterozyg.
88	HD		1									heterozyg.
89	HD		0
90	HD		1				heterozyg.
91	FN		1	heterozyg.
92	FN		0
93	FN		1	heterozyg.
94	FN		1										heterozyg.
95	FN		0
96	FN		1	heterozyg.
97	FN		1				heterozyg.
98	FN		1									heterozyg.
99	HD	PE	0
100	HD	PE	1									heterozyg.
101	HD	PE	1									heterozyg.
102	FN		0
103	HD	Gestačná hypertenzia, HELLP	0
104	HD	PE	0
105	HD	PE	1									heterozyg.
106	HD	Gestačná hypertenzia	1	heterozyg.
107	FN		1								heterozyg.
108	HD	PE (gestačná hypertenzia, IUGR)	1									heterozyg.
109	FN		0
110	FN		0
111	HD	PE	0
112	HD	PE	0
113	FN		0
114	FN		0
115	FN		0
116	FN		1									homozyg.
117	FN		1									heterozyg.
118	FN		0
119	FN		0
120	FN		0
121	FN		0
122	FN		1									heterozyg.
123	FN		0
124	HD	IUGR neskorá	0
125	FN		0
126	FN		0
127	FN		0
128	FN		1									homozyg.
129	FN		0
130	FN		1									heterozyg.
131	FN		1									heterozyg.
132	FN		1	heterozyg.
133	FN		0
134	FN		1									heterozyg.
135	FN		1									heterozyg.
136	FN		0
137	FN		0
138	FN		1									heterozyg.
139	FN		0
140	FN		1									heterozyg.
141	FN		1									heterozyg.
142	FN		0
143	FN		5	homozyg.										heterozyg.	heterozyg.	heterozyg.	heterozyg.
144	FN		0
145	FN		1									heterozyg.
146	FN		1									heterozyg.
147	FN		0
148	FN		1									heterozyg.
149	FN		1					heterozyg.
150	FN		1	heterozyg.
151	FN		1									homozyg.
152	HD	PE neskorá	0
153	FN		1									heterozyg.
154	FN		0
155	FN		1									heterozyg.
156	FN		1									heterozyg.

Varianty vs QPCR


			VARIANT	rs112171707	rs150596337	-	rs555416193	rs149888808	-	rs1238265137	rs192755521	rs4727276	rs569899772	rs990071845	rs944910258	rs911934432	rs187902619	rs191798317	rs144621394	ERVW-1				ERV-FRD
			LOKALIZÁCIA VZHĽADOM NA ERWV-1	c.-2378C>A	c.-2372G>A	c.-2349_-2350insA	c.-2084C>T	c.-2048G>A	c.-1973A>T	c.-1972G>T	c.-1514T>C	c.-1284G>C	c.-1068C>T	c.-667A>G	c.-664A>G	c.-644A>G	c.-631T>C	c.-628C>A	c.-519C>T	ΔCt (CtE1 - CtRP)		ΔCt (CtE1 - CtYW)		ΔCt (CtS2 - CtRP)		ΔCt (CtS2 - CtYW)
			GENOMICKÁ LOKALIZÁCIA	92479532	92479526	92479503 - 92479502	92479238	92479202	92479127	92479126	92478668	92478438	92478222	92477821	92477818	92477798	92477785	92477782	92477673	Δ Ct mean	Δ Ct SD	Δ Ct mean	Δ Ct SD	Δ Ct mean	Δ Ct SD	Δ Ct mean	Δ Ct SD
PORADOVÉ ČÍSLO	PE / FN	DIAGNÓZA	POČET MUTÁCIÍ
99	HD	PE	0																	1.4134	0.9377	0.6648	0.3267	4.5459	1.3504	3.9452	0.9177
100	HD	PE	1									heterozyg.								1.2182	0.8147	0.5470	0.4187	4.1141	0.8256	3.4429	0.4777
101	HD	PE	1									heterozyg.								0.1578	1.4387	0.4515	0.4607	4.6476	0.7603	4.9413	0.6329
102	FN		0																	4.3630	0.9971	0.1713	0.3717	7.9594	0.8321	3.7678	0.3474
103	HD	Gestačná hypertenzia, HELLP	0																	0.8059	1.2528	0.4466	0.2349	5.2498	1.7061	4.8905	0.9873
105	HD	PE	1									heterozyg.								0.4374	0.9333	-0.5488	1.3098	5.7495	0.8978	4.7634	0.6123
106	HD	Gestačná hypertenzia	1	heterozyg.																1.8004	0.6756	1.0843	0.3403	7.0754	0.5542	6.3593	0.4095
107	FN		1								heterozyg.									1.2149	0.8900	1.1736	0.6794	6.6219	0.7422	6.5805	0.6673
108	HD	PE (gestačná hypertenzia, IUGR)	1									heterozyg.								2.0150	1.1700	1.1079	0.4018	7.4130	0.9741	6.5059	0.3949
109	FN		0																	4.0869	1.1400	1.1964	0.9440	7.6719	0.7046	4.7814	0.1718
111	HD	PE	0																	0.4492	0.6274	0.1644	0.2314	6.7174	0.5311	6.4326	0.6552
112	HD	PE	0																	0.8764	0.6065	0.8677	0.1549	2.7593	0.6119	2.7506	0.2120
114	FN		0																	1.3747	0.8436	0.5877	0.5258	7.3188	0.7861	6.5317	0.3868
115	FN		0																	3.3568	0.8530	1.6060	0.5593	5.2832	1.1313	3.5324	0.3974
116	FN		1									homozyg.								2.5005	1.0524	1.9577	0.2815	3.9206	1.2756	3.3778	0.4341
117	FN		1									heterozyg.								3.3266	2.9804	2.1173	1.3554	7.0635	2.6684	5.8543	1.1802
118	FN		0																	2.1802	0.8667	1.5217	0.2835	5.6185	0.6514	4.9600	0.2185
119	FN		0																	4.0019	1.5069	0.8200	0.5375	7.6594	0.9787	4.4776	0.5071
120	FN		0																	4.7657	0.9239	1.6143	0.5265	8.6486	0.7929	5.4972	0.5318
121	FN		0																	3.7820	1.1105	1.4142	0.2580	8.1926	0.9483	5.8247	0.3440
122	FN		1									heterozyg.								3.5133	1.0103	0.6996	0.2596	8.1731	1.1359	5.3594	0.2436
123	FN		0																	3.6271	0.3983	1.5418	0.2447	5.7865	0.7087	3.7012	0.3792
124	HD	IUGR neskorá	0																	3.0764	0.7574	0.1766	0.1832	7.2688	0.8060	4.3691	0.2884
125	FN		0																	3.2427	1.1223	0.3470	0.9354	7.0136	1.0348	4.1179	0.8537
126	FN		0																	3.6387	0.7506	0.4176	0.4044	7.1477	0.6936	3.9266	0.3267
127	FN		0																	4.5577	2.3603	0.8295	1.1277	8.5424	2.3164	4.8141	0.8121
128	FN		1									homozyg.								0.3585	1.0915	0.2119	0.1944	4.4377	0.9090	4.2911	0.3743
133	FN		0																	1.7730	1.5821	-0.4190	0.4779	6.0423	1.4003	3.8502	0.3184
134	FN		1									heterozyg.								-0.6554	0.4183	0.0032	0.3352	3.6942	0.5198	4.3528	0.5541
135	FN		1									heterozyg.								2.8249	0.6738	1.1743	0.1176	5.9834	0.6641	4.3328	0.3804
136	FN		0																	2.9805	0.7812	0.9014	0.1208	6.3754	0.6906	4.2962	0.2599
137	FN		0																	4.5014	1.8402	2.2747	1.9852	6.5904	0.5976	4.3637	0.4882
138	FN		1									heterozyg.								2.9474	1.4449	1.6593	0.2144	6.3402	1.3965	5.0521	0.3268
139	FN		0																	4.8607	0.7941	1.2152	0.4250	7.5853	0.7655	3.9398	0.3466
140	FN		1									heterozyg.								3.9624	0.3158	1.5593	0.3581	6.4141	0.6947	4.0110	0.4944
141	FN		1									heterozyg.								3.8290	0.7537	1.1973	0.4245	5.7411	0.8502	3.1094	0.3319
142	FN		0																	3.0324	0.7408	1.3878	0.2497	5.6662	0.6276	4.0216	0.2558
143	FN		5	homozyg.										heterozyg.	heterozyg.	heterozyg.	heterozyg.			5.2983	0.7600	1.3591	0.2990	5.8489	0.7961	3.9885	0.3122
144	FN		0																	5.6677	1.4458	2.3632	1.0129	5.0556	3.0892	1.7511	3.4425
145	FN		1									heterozyg.								3.5824	0.9570	1.7800	0.2465	6.4006	0.6330	4.5982	0.3749
146	FN		1									heterozyg.								5.2655	0.7142	2.2089	0.2623	8.1686	0.4093	5.1121	0.3720
147	FN		0																	4.3029	0.2671	1.4371	0.1796	7.5895	0.2340	4.7237	0.1347
148	FN		1									heterozyg.								5.3333	0.8927	1.9071	0.3284	8.0407	0.6341	4.6144	0.2032
149	FN		1					heterozyg.												5.4401	2.1752	2.0332	1.0555	8.9771	1.9538	5.5702	1.0799
150	FN		1	heterozyg.																4.4193	0.8273	1.6257	0.2582	7.6462	0.8000	4.8526	0.5104
151	FN		1									homozyg.								3.0615	0.7218	1.5017	0.1541	5.7227	0.7820	4.1628	0.2797
152	HD	PE neskorá	0																	1.7481	1.1223	1.1972	0.3068	3.5044	0.9349	2.9535	0.2982
153	FN		1									heterozyg.								4.3585	1.1463	1.7712	0.4883	6.1453	0.8530	3.5579	0.4931

SYNCYTÍN-1 ako nový marker preeklampsie, druhej najčastejšej príčiny úmrtia gravidných žien.